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八探针荧光原位杂交联合R显带技术诊断儿童急性淋巴细胞白血病


来源:乐橙娱乐官网 | 时间:2018-10-07

  急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)占儿童急性白血病的80%,发病率高峰在3~7岁之间。近年来细胞遗传学检测已成为ALL诊断与预后评估必不可获缺的部分,而儿童ALL的染色体制备通常较难,即使能发现中期分裂相,但大多聚集成团且显带不清致使无法分析,一些染色体微小异常或复杂易位均不能有效鉴别。而间期荧光原位杂交技术(fluorescencehybridization, FISH)可为染色体核型分析技术的局限性可提供有力的补充[]。FISH检测的灵敏度远高于G显带和R显带核型分析,有助于提高白血病诊断的准确性和灵敏性,对于判定白血病的预后具有重要的作用。在本研究中我们应用八探针FISH系统(E2A、CHIC2/D10Z1/D17Z1、TEL/AMLl、MLL、IGH的DNA探针)检测ALL常见的8种细胞遗传学异常,同时与R显带染色体核型分析比较,评估八探针FISH系统在儿童ALL诊断中应用价值以及细胞遗传学异常的分析[],并评估两种技术在儿童ALL诊断中细胞遗传学差异方面的优缺点。

  2011年10月至2014年10月在我院血液肿瘤科门诊及住院的ALL初诊患儿237例,所有病例诊断均符合《血液病诊断和疗效标准》[]。均签署了知情同意书。

  直接培养法和短期培养法制备骨髓细胞染色体,应用R显带技术按国际细胞遗传学命名标准(ISCN 2009)进行核型分析,每例标本通常要求分析20~25个中期分裂相[]。

  FISH八探针包括针对MYC断裂基因、P16缺失、E2A/PBX1融合基因、CHIC2/D10Z1/D17Z1多倍体、TEL/AML1融合基因、MLL断裂基因、BCR/ABL融合基因、IGH断裂基因的8组探针(英国Cytocell人类FISH探针血液病探针),按设计组合标记固定于一张检测玻片上,进行标本处理、变性、杂交、杂交后洗脱操作。

  在奥林巴斯BX51荧光显微镜下通过三色滤光块(DAPI/TRITC/FITC) 观察杂交信号,FISH 2.0荧光图像分析系统(俄罗斯VideoTesT)进行图像分析,每份间期核标本计数200个细胞,阳性细胞比例占10%左右可判为阳性结果()。

  所得数据采用SPSS 17.0软件进行卡方检验,P0.05为差异有统计学意义。

  八探针FISH与R显带核型分析在135例ALL患者中检测细胞遗传学异常结果比较

  本研究的八探针FISH系统联合R显带染色体核型分析技术在儿童ALL患者TEL/AML1融合基因和CHIC2/D10Z1/D17Z1多倍体检测中的阳性率较高,而BCR/ABL融合基因的阳性率最低。这与成人ALL患者的检测结果相反,成人ALL较儿童ALL患者预后较差。成人与儿童ALL患者的预后差异可能与二者在细胞遗传学方面的差异有关[]。

  MYC致癌基因的易位是诊断B-ALL中Burkitt白血病/淋巴瘤ALL-L3重要标记。MYC易位重排的患者预后较差,完全缓解率低,但这些易位对强力化疗反应良好,可增加患者生存率。

  肿瘤抑制基因p16缺失:9p21缺失会引起很多肿瘤病,包括大约10%的儿童ALL患者,可发现9p21缺失重排。FISH检测诊断出90%的儿童ALL患者有P16/CDKN2A缺失导致的肿瘤发生。该异常导致与细胞周期调节有关的3个基因P14、P15、P16的单个或多个缺失,可能与白血病发病有关[]。

  t(1;19)(q23;p13)易位导致位于1q23的PBX1基因和位于19p13的E2A基因并置在一起,形成E2A/PBX1融合基因。细胞遗传学上有两种亚型:平衡型t(1;19)占25%;不平衡型der(19)t(1;19),导致1q部分三体,占75%。后者预后优于前者,而t(1;19)易位的患者有更高的复发率。

  t(12;21)(p13;q22)异常见于12%~27%的儿童B细胞ALL,为儿童B细胞中最常见的畸变,CR率高,复发少见,预后较好。在ALL中该易位导致位于12p13的TEL基因和位于21q22的AML1基因并置在一起,形成TEL/AML1融合基因[]。由于该异常十分微小,两条染色体相互易位片段的大小和条带十分相似,常规核型分析方法对t(12;21)的检出率不到0.05%时一般不能发现,用FISH或RT-PCR才能检出。

  MLL基因异常主要是由染色体11q23断裂重排所致,但发生易位的伙伴基因或染色体种类较多[]。儿童急性白血病约5%~10%可检测到MLL基因的改变[]。11q23的染色体异常导致位于11q23的混合谱系白血病基因发生重排形成MLL/AF4融合基因,该基因在大部分婴幼儿ALL中可监测到。Bardini等[]报道MLL基因阳性婴幼儿白血病发生机制与其它类型白血病不同,预后更差。WHO在对白血病重新分类中将其单独列为11q23/MLL白血病。

  BCR/ABL融合基因是诊断慢性粒细胞白血病的重要指标之一,也是影响儿童ALL预后的一个重要原因。BCR/ABL融合基因阳性的ALL是儿童白血病中最难治的。这类患者白细胞计数较低且对起始化疗反应快或者行相关供者骨髓移植,但仍需新的治疗方法。

  IgH基因重排最常见于T细胞ALL,也可见于B细胞ALL。这些重排在IgH基因内部有断裂点,因此IgH探针可以检测任何形式的IgH重排,故在ALL病程中对IgH基因重排进行联合的动态监测,极大地提高白血病微小残留病检出的特异性和敏感性。

  大约60%~85%的ALL有克隆性染色体畸变,其中66%为特异性染色体重排。ALL按染色体众数可分为6种亚型:(1)50的超二倍体,见于25%~30%的儿童ALL患者,FAB分型为ALL-L1或L2;(2)47~50的超二倍体,见于10%~15%的ALL患者,FAB分型为ALL-L1或L2;(3)假二倍体,见于40%的ALL患者,染色体数目为46,但有各种数目和结构的畸变,常伴有白细胞计数和乳酸脱氢酶(LDH)增高,预后大都很差;(4)正常二倍体,见于10%~15%的ALL患者,FAB分型为ALL-L1或L2,T细胞ALL中正常核型者高达30%,预后一般;(5)亚二倍体或近单倍体,前者的染色体数目46,见于7%~8%的ALL患者,后者的染色体数目30,见于不到1%的ALL患者。FAB分型为ALL-L1或L2;(6)近三倍体或近四倍体,见于1%的儿童ALL患者,预后一般不佳[,,]。

  综上所述,儿童ALL患者染色体畸变形成的融合基因各不相同,其临床表现、免疫分型、对治疗的反应及预后意义也不同。八探针FISH技术较R显带染色体核型分析具有准确、高效、省时、省力等优点,可与染色体核型分析有效互补,两种技术联合应用于儿童ALL的诊断,可以一次性检测出ALL可能出现的多种细胞遗传学的改变,完善白血病的细胞遗传学诊断,极大地提高了检测的效率,为白血病患者的个体化治疗提供重要的依据。